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人血栓素A2(TXA2)ELISA检测试剂盒实验原理
发布时间:2022-11-15      点击次数:319

试验原理:
TXA2试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知TXA2浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将TXA2和标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中TXA2的浓度呈比例关系。
试剂盒内容及其配制
试剂盒成份(2-8℃保存)    96孔配置    48孔配置    配制
96/48人份酶标板    块板(96T)    半块板(48T)    即用型
塑料膜板盖    块    半块    即用型
标准品:8.0ng/ml    瓶(0.6ml)    瓶(0.3ml)    按说明书进行稀稀
空白对照    瓶(.0ml)    瓶(0.5ml)    即用型
标准品稀释缓冲液    瓶(5ml)    瓶(2.5ml)    即用型
标记的抗TXA2抗体    瓶(6ml)    瓶(3.0ml)    即用型
亲和链酶素-HRP    瓶(0ml)    瓶(5.0ml)    即用型
洗涤缓冲液    瓶(20ml)    瓶(0ml)    按说明书进行稀释
底物A    瓶(6.0ml)    瓶(3.0ml)    即用型
底物B    瓶(6.0ml)    瓶(3.0ml)    即用型
终止液    瓶(6.0ml)    瓶(3.0ml)    即用型
标本稀释液    瓶(2ml)    瓶(6.0ml)    即用型
自备材料
.蒸馏水。
2.加样器:5ul、0ul、50ul、00ul、200ul、500ul、000ul。
3.振荡器及磁力搅拌器等。
安全性
.避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体,请尽快用水冲洗。
2.实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3.不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
操作注意事项
.试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。
2.实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。
3.不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4.使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器。
5.使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6.洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7.底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。
8.加入试剂的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9.按照说明书完美体育平台明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
样品收集、处理及保存方法
、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后,000×g离心0分钟将血清和红细胞完美体育平台小心地分离。
2、血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。000×g离心30分钟去除颗粒。
3、细胞上清液---000×g离心0分钟去除颗粒和聚合物。
4、组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。000×g离心0分钟,取上清液
5、保存------如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70 ℃保存,避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
试剂的准备
.标准品:标准品的系列稀释应在实验时准备,不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行:
8.0 ng/ml    (6号标准品)    原倍浓度不用稀释直接加入50ul。
4.0 ng/ml    (5号标准品)    00ul的原倍标准品加入00ul的标准品稀释液
2.0 ng/ml    (4号标准品)    00ul的5号标准品加入00ul的标准品稀释液
.0 ng/ml    (3号标准品)    00ul的4号标准品加入00ul的标准品稀释液
0.5 ng/ml    (2号标准品)    00ul的3号标准品加入00ul的标准品稀释液
0.25 ng/ml    (号标准品)    00ul的2号标准品加入00ul的标准品稀释液
0 ng/ml    (空白对照)    原始浓度不用稀释直接加入50ul。
2.洗涤缓冲液(50×)的稀释:蒸馏水50倍稀释。

操作步骤
.使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差。
2.根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液:稀释后加入50ul于反应孔内。
3.加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育小时。
4.甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
5.每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟。
6.甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
7.每孔加入底物A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育0分钟。避免光照。
8.取出酶标板,完美体育平台加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果。
9.在450nm波长处测定各孔的OD值。

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