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、 简介 
货号：HB-94-2 
为了适应贝类诺沃克病毒快速检测和疫病研究的需要，完美体育平台根据 2005 年国家质量监督管理总
局发布的出入境检验检疫行业标准(SN/T 635-2005)中的的引物和探针序列，经多次实验及系
统优化，开发生产了本试剂盒。应用本试剂盒进行检测具有快速、灵敏、特异、准确、安全操作简
单、应用广泛和高通量检测等特点及优点。
2、 试剂盒组成 
试剂盒组成包括核酸扩增试剂。具体组成参见表 ：
表 ：试剂盒组成（50test/盒）
试剂盒组成成分 体积 
核酸提取试剂： 核酸裂解液 5ml×2 管
核酸扩增试剂： DEPC 水
诺沃克 GII 型荧光 RT-PCR 反应液
酶混合物
阴性对照
诺沃克 GII 型 阳性对照
 ml× 管
750µL× 管
60µL× 管
ml× 管
ml× 管
（注：核酸提取试剂可使用完美体育平台生产的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取试剂盒》） 
3、 样本采集,存放及运输 
3. 样本采集：所用取样器材必须经高压灭菌并烘干。
取贝类中肠腺组织约 5 g，加入 35 mL 的缓冲液高速匀浆，37℃孵育 30 min，4℃ 0,000g
离心 30 min。取上清，加入等体积 PEG8000，反复颠倒混匀，冰上放置 h，4℃ 0,000g 离心 5 min，
弃上清。保留沉淀备用。
3.2 存放：样本在 2 ℃—8 ℃条件下保存应不超过 24 h；-70 ℃以下可保存，但应避免反复冻
融（zui多冻融 3 次）。
3.3 运输：采用泡沫箱加冰密封进行运输。
4、 荧光 RT-PCR 检测 
4. 操作方法 
4.. 样本的处理（在样本制备区进行）：
4... 取 n 个灭菌的 .5 mL Eppendorf 管，其中 n 为被检样品与阴性对照的和（阳性对照、阴性
对照在试剂盒中已标出），做标记。(注：试剂盒中的阳性对照直接作为 PCR 检测的模板，无需
提取核酸)
4...2 每管加入 600 µL 裂解液，分别加入被检样本和阴性对照各 200 µL，一份样本换用一个吸
头，混匀器上振荡混匀 5 s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用
手颠倒混匀），于 4℃ 2 000 r/min 离心 5 min。
4...3 取与 4... 相同数量灭菌的 .5 mL Eppendorf 管，加入 500 µL 异丙醇（-20℃预冷），
做标记。吸取 4...2 各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取 500µL，不能吸
出中间层，颠倒混匀。
4...4 于 4 ℃、2 000 r/min 离心 5 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小
心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)；加入 600 µL 75％
乙醇，颠倒洗涤。
4...5 于 4 ℃、2 000 r/min 离心 0 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小
心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。
4...6 4 000 r/min 离心 0s（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余
液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要
碰到有沉淀一面，室温干燥 3 min，不能过于干燥，以免 RNA 不溶。
4...7 加入 µL DEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心 5 s，冰上保存备
用。提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需保存须放置-70 ℃冰箱内。
【也可参照《病毒 RNA 柱式提取试剂盒说明书》（货号：HB-QPCR-0）使用，更方便快捷提取
核酸】。
注：提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需保存须放置-70 ℃冰箱内。 
4..2 检测
4..2. 扩增试剂准备（在反应混合物配制区进行）：
从试剂盒中取出相应的荧光 RT-PCR 反应液、酶混合物，在室温下融化后，2000 r/min 离心 5 s。
设所需荧光 RT-PCR 检测总数为 n，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反
应体系配制见表 2：
表 2 每个样品测试反应体系配制表
试剂 RT-PCR 反应液 酶混合物
用量 5 μL .0 μL
根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，充分混合均匀，向每个
荧光RT-PCR管中各分装6 µL，转移至样本处理区。
4..2.2 加样（样本处理区进行）：
在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤4...7中制备的RNA溶液各0 µL，盖紧
管盖，500 r/min离心30 s。
4..2.3 荧光 RT-PCR 检测（在检测区进行）：
将4..2.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
循环条件设置：
*阶段，反转录48
o
C /45 min，50 o
C /2 min
第二阶段，预变性95 o
C/0 min；
第三阶段，95 o
C/5s，60 o
C/60s，40个循环，在第三阶段每次循环的60 o
C退火延伸时收集荧光。
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
4.2 结果判定 
4.2. 结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样
品扩增曲线的zui高点为准。
4.2.2 质控标准
4.2.2. 阴性对照无 Ct 值或无扩增曲线。
4.2.2.2 阳性对照的 Ct 值应<25.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
4.2.3 结果描述及判定
4.2.3. 阴性
无Ct值或无扩增曲线，示样品中无诺沃克病毒GII型核酸。
4.2.3.2 阳性
Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，示样品中存在诺沃克病毒GII型核酸。
4.2.3.3 有效原则
Ct值>30的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。
5、 相关技术信息（引物和探针序列） 
F：CARGARBCNATGTTYGRTGGATGAG
R：TCGACGCCATCTTCATTCACA
Probe：FAM-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-TAMRA