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检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠胱天蛋白酶9（Casp-9）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并*洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠胱天蛋白酶9（Casp-9）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法

.  血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心0分钟将血清和红细胞完美体育平台小心地分离。

2.  血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.  细胞上清液：3000转离心0分钟去除颗粒和聚合物。

4.  组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心0分钟取上清。

5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

酶标仪（450nm）
高精度加样器及枪头：0.5-0uL、2-20uL、20-200uL、200-000uL
37℃恒温箱
操作注意事项

  试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶*溶解后再使用。
  实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
  标准品稀释液即可视为阴性对照或者空白；预处理后的样本无需稀释，直接取0μL加样即可。
  严格按照说明书完美体育平台明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
  所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成

名称

96孔配置

48孔配置

备注

微孔酶标板

2孔×8条

2孔×4条

无

标准品（64 pmol/L）

0.6mL

0.6mL

按说明书进行稀释

标准品稀释液

6mL

3mL

无

样本稀释液

6mL

3mL

无

检测抗体-HRP

0mL

5mL

无

20×洗涤缓冲液

25mL

5mL

按说明书进行稀释

底物A

6mL

3mL

无

底物B

6mL

3mL

无

终止液

6mL

3mL

无

封板膜

2张

2张

无

说明书

份

份

无

自封袋

个

个

无

注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：64、32、6、8、4、2 pmol/L

试剂的准备

 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按：20稀释，即份的20×洗涤缓冲液加9份的蒸馏水。

洗板方法

  手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。
  自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡min，洗板5次。
操作步骤

  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
  待测样本孔先加待测样本0μL，再加样本稀释液40μL；
  随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体00μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育5min。
  每孔加入终止液50μL，5min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断

 绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线完美体育平台计算各样本浓度值。

试剂盒性能

.  准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。

2.  灵敏度：zui低检测浓度小于.0 pmol/L。

3.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.  重复性：板内、板间变异系数均小于5%。

5.  贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6个月