PCR反应条件-完美体育平台生物
)PCR反应成分
)模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。
DNA模板一般00ng /00?L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
2)引物浓度
0.-0.5 ?mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
(3)Taq DNA聚合酶
0.5-2.5 U/50 ?l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
4)dNTP(0mM or 2.5mM )
含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。
5) Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。浓度为0.5-2.5mmol/L。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降; Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
2)循环参数
变性
使双链DNA解链为单链
94℃, 30-60秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。
引物设计:
()序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源
序列。
(2)引物长度以5-40 bp为宜。
(3)碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。
(4)引物内部避免形成二级结构。
(5)两引物间避免有互补序列。
(6)引物3’端为关键碱基;5’端无严格限制。
3)延伸
70-75℃,一般为72℃
延伸时间由扩增片段长度决定
(4)循环次数
主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次
次数过多:扩增效率降低
错误掺入率增加
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