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【产品名称】曲霉属完美体育平台探针法荧光定量PCR试剂盒
Aspergillus spp. Aspergillus spp.Probe qPCR Kit
【型号:】GOYL44N
【产品及特点】曲霉属,曲霉目中的一属,包括米曲霉、黑曲霉等。一方面有很多菌种可被用于各种有益物质的生产,如用于蛋白消化剂的蛋白酶(酱油曲霉)、柠檬酸(黑曲霉)、衣康酸(土曲霉、解乌头酸曲霉)以及曲酸(黄曲霉)等。但另一方面,也有不少侵害家禽、家畜甚至人体内脏特别是呼吸器官的病菌,如引起曲霉症的烟曲霉等。因此快速灵敏检测曲霉属具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测曲霉属完美体育平台的试剂盒,它具有下列特点:
1.即开即用,用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化,灵敏性高。
3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4.特异性高,引物是根据曲霉属完美体育平台DNA高度保守区设计,不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
7本产品只能用于科研。
曲霉属完美体育平台探针法荧光定量PCR试剂盒【规格及成分】
成分 | 规格 |
A | 500 μL |
B | 1 mL |
C | 1 mL |
D | 150 μL |
E | 50 μL |
使用手册 | 1份 |
【运输及保存】低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。
【自备试剂】 样品 DNA。
【使用方法】一、稀释标准曲线样品(以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管,分别为6,5,4,3,2,1。
2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液,用带芯枪头,下同。
3.在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头,在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7.如果有N个样品待提取,设置N+2个提取,多出的是PC(样品制备阳性对照)和NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL再加上一定量的水,使总体积与待提取样品的规定体积一致,以此作为PC。另外用水作为NC。
8.用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数兼容。
三Probe qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
9.如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR
阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
成分 | 样品管 N+2 个 | PCR 阴性对照 | 标准曲线样品管 (1-6 管) |
A | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
D | 3 μL | 3μL | 3 μL |
N+2个待测DNA模板 | 7 μL | - | - |
C | - | 7 μL | - |
第6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号) | - | - | 7 μL(1 号样到 1 号管,2 号样到 2 号管…) |
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 10 min |
PCR反应 (45个循环) | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 60 sec(采集FAM通道的荧光信号) |
12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。
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